青岛地区哺乳动物隐孢子虫感染调查
作者：尼宏莉 宫玉香 韩晶 张忠广 杨永洁
【摘要】 目的 了解青岛地区哺乳动物隐孢子虫感染状况及最佳检测方法。方法 收集青岛地区某些县(市)的猪、狗、猫及青岛大学医学院寄生虫学教研室实验用小鼠、大鼠、兔粪便388份，分别应用改良抗酸染色、金胺酚染色、金胺酚串联改良抗酸染色法检测隐孢子虫，并在生理盐水、饱和盐水及碘液中对隐孢子虫卵囊进行形态学观察。用腹泻儿童粪便中分离隐孢子虫卵囊感染2只幼犬，对其进行病原学和病理学观察。结果 哺乳动物隐孢子虫检出率为15.98%(62/388)，其中家养动物猪、狗和猫隐孢子虫检出率分别为4.71%（8/170）、22.22%（10/45）和0（0/15），实验动物小鼠、大鼠和兔隐孢子虫检出率分别为31.03%（9/29）、40.00%（24/60）和15.94%（11/69）。实验动物隐孢子虫检出率（27.85%）明显高于家养动物（7.86%）(χ2=27.965，P<0.01)。人隐孢子虫卵囊感染幼犬后产生明显腹泻症状，粪便中查到隐孢子虫卵囊，大小形态与人株相似，肠壁病变明显。结论在青岛地区哺乳动物中查出隐孢子虫感染，金胺酚串联改良抗酸染色法效果最好。对甲醛液保存时间较长的粪便标本，金胺酚染色法染色后，用体积分数0.03盐酸乙醇脱色5 min，再用改良抗酸法染色,可提高卵囊检出率。隐孢子虫人株对狗无宿主特异性，并且具有明显致病性。
【关键词】 隐孢子虫属 哺乳动物 寄生虫感染 体外 数据收集
［ABSTRACT］ Objective To investigate Cryptosporidium infection in mammals in Qingdao region. Methods A total of 388 specimens was collected from feces of pigs, cats and dogs in rural areas of Qingdao, and experimental rats, mice and rabbits of Department of Parasitology of Qingdao University Medical College. Feces smears were stained with iodine, modified acidfast staining, Auraminephenol staining and combined method with Auraminephenol staining and acidfast staining. Crytosporidium egg capsules separated from feces of diarrhea children were used to infect two puppies, the etiology and pathology were studied. Results The detection rate of Cryptosporidium was 15.98%(62/388), in which, the detection of domesticated pigs, dogs and cats was 4.71%, 22.22% and 0, respectively, and that of experimental mice, rats and rabbits was were 31.03%, 40.00% and 15.94%, respectively. The detection of cryptosporidium in the experimental animals (27.85%) was significantly higher than that of the domesticated ones (7.86%) (χ2=27.965,P<0.01). Puppies infected with human cryptosporidium egg capsules showed diarrhea and cryptosporidium egg capsules were found in their feces similar to human strain in size and shape. Pathological changes in intestine wall were significant. Conclusion Mammals in Qingdao region area are infected with Cryptospodium. Combined auraminephenol staining with acidfast staining is the best choice to detect this infection. For specimen preserved in formalin for a longer time, 3% hydrochloric acid alcohol decoloration for five minutes after Auraminephenol staining, followed by modified acidfast staining can highly raise the detection rate of Cryptosporidium. Human strain of Cryptospodium has no host specificity in dogs and show significant pathogenicity.
［KEY WORDS］ Cryptospodium; Mammals; Ectoparasitic infestations; Data collection
隐孢子虫在人群常引起以腹泻为主要症状的隐孢子虫病流行或暴发流行，有六大洲90多个国家发现人体隐孢子虫病[1]。已有研究显示，隐孢子虫可感染包括人在内的170多种动物，其中哺乳动物隐孢子虫感染在人类隐孢子虫病的传播中起着重要作用[2]。我国哺乳动物隐孢子虫感染已有报道[3～13]。本文对青岛地区哺乳动物隐孢子虫感染情况进行调查，并用其人株对幼犬进行人工感染及病理学观察，现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 标本及其来源
收集青岛市胶州、即墨等地的猪、狗、猫及青岛大学医学院寄生虫学教研室实验用小鼠、大鼠、兔粪便共388份,保存于粪便盒或盛有40 g/L甲醛的瓶内备检。
1.2 隐孢子虫检测
1.2.1 改良抗酸染色法 染液配制如下。石炭酸复红染液（第1液）：碱性复红4 g，体积分数0.95的乙醇20 mL，石炭酸8 mL，蒸馏水100 mL；体积分数0.10硫酸溶液（第2液）：纯硫酸10 mL，蒸馏水90 mL（边搅拌边将硫酸徐徐倾入蒸馏水中）；孔雀绿液（第3液）：20 g/L孔雀绿原液1 mL，蒸馏水10 mL。操作步骤:将动物粪便于干净载玻片上涂成粪膜,干后加甲醇固定5 min,吹干; 滴加第1液染5～10 min,水洗；滴加第2液染1～5 min后水洗；滴加第3液，1 min后水洗；干后置显微镜下观察。
1.2.2 金胺酚染色法 试剂配制如下。1 g/L金胺酚（第1液）：金胺酚0.1 g,石炭酸5.0 g,蒸馏水100 mL;体积分数0.03盐酸乙醇（第2液）： 盐酸3 mL，体积分数0.95乙醇100 mL；5 g/L高锰酸钾（第3液）：高锰酸钾0.5 g,蒸馏水100 mL。染色步骤：粪膜用甲醇固定5 min后水洗；加第1液染10～15 min后水洗；滴加第2液染1 min后水洗；滴加第3液，1 min后水洗；晾干后置荧光显微镜下观察。
1.2.3 金胺酚串联改良抗酸染色法(简称复染法)先用金胺酚染色法染色,再用改良抗酸染色法复染，直接在光学显微镜下观察，可消除非特异性红颗粒。对40 g/L甲醛溶液保存时间较长的标本，金胺酚染色法染色后，用体积分数0.03盐酸乙醇脱色5 min，再用改良抗酸染色法复染, 光学显微镜下观察。
1.3 隐孢子虫卵囊形态观察
将隐孢子虫阳性粪便在生理盐水、饱和盐水、碘液涂片中仔细观察隐孢子虫卵囊的形态特点。光镜下利用测微器测量隐孢子虫卵囊大小。
1.4 动物人工感染实验
取在20 g/L重铬酸钾液中保存的隐孢子虫阳性的儿童腹泻粪便,两层纱布过滤,取粪液调制为2.6×106 /L的悬液。取出生15 d尚未断奶的幼犬2只（粪检隐孢子虫卵囊为阴性），经胃管接种4 mL制备好的含卵囊悬液，然后分笼饲养，每日4次人工喂饲煮沸过的奶粉，观察并记录其临床表现。采用复染法每日查粪便,并测量100个卵囊大小。于感染后第8天和第9天分别处死动物，解剖后肉眼观察各脏器，取肠道不同部位内容物涂片查卵囊；取不同部位肠黏膜分别放入40 g/L甲醛液中固定,制备组织学切片,进行病理学观察。取有溃疡的肠壁组织，修成1 mm×5 mm左右的长条，立即放入体积分数为0.025的戊二醛固定液中固定4 h， 缓冲液清洗3次，每次10 min；体积分数为0.10的锇酸固定1 h； 缓冲液清洗3次，每次10 min；依次浸泡于预冷的125、250、500 g/L的二甲基亚矾溶液中各20 min，中间换液1次；液氮冷冻断裂，然后放入500 g/L的二甲基亚矾溶液中10 min，用磷酸缓冲液浸洗60 min。乙醇系列脱水、临界点干燥，金属镀膜，JSM840扫描电镜观察。
1.5 统计学分析
使用SAS 9.1统计软件进行统计分析，数据间比较采用卡方检验。
2 结果
2.1 隐孢子虫检出情况
家养动物隐孢子虫检出率为7.86%，其中猪为4.71%，狗为22.22%，猫未检测到；实验动物隐孢子虫检出率为27.85%，其中小鼠为31.03%，大鼠为40.00%,兔为15.94%。实验动物隐孢子虫检出率明显高于家养动物（χ2=27.965，P<0.01）。见表1。
表1 动物隐孢子虫检测结果动物n阳性数量检出率（略）
2.2 隐孢子虫卵囊形态
2.2.1 光镜观察 生理盐水直接涂片标本隐孢子虫卵囊为无色透明并具折光性圆形小体，不易与粪便中的折光性物体相区别。饱和盐水漂浮后卵囊变小,呈月牙形、马蹄形、肾形或三角形。经碘液染色后卵囊为淡绿色的圆形小体，油镜下观察，圆形小体多呈淡灰色，个别为淡黄色，而酵母菌或其他原虫包囊呈棕色或棕红色；囊壁光滑，内部可见发亮的条索状或颗粒样物。改良抗酸染色后标本背景为蓝绿色，卵囊为玫瑰红色的圆形或椭圆形小体，内部可见条索状或点状的子孢子；非特异抗酸颗粒也染为红色，但内部均匀，无条索或颗粒状内含物。复染法标本背景清晰呈蓝绿色，低倍镜下可见针尖大小的红点；油镜观察卵囊壁无色透明，内部可见条索状或颗粒状子孢子（图1），子孢子溢出的卵囊为无色透明的圆形小体，未见非特异抗酸红颗粒。
粪便经40 g/L甲醛溶液保存时间越长,改良抗酸染色越难着色，保存1年以上的卵囊几乎不能着色。对40 g/L甲醛溶液保存时间长的标本做涂片，金胺酚染色法染色后，用体积分数0.03盐酸乙醇脱色5 min，再用改良抗酸法染色，卵囊着色率达65.1%（23/35）;而未用体积分数0.03盐酸乙醇脱色者卵囊着色率为36.84%（7/19），二者差异有显著性（χ2= 4.158，P<0.05）。
2.2.2 荧光镜观察 金胺酚染色后荧光镜低倍镜下观察，卵囊为黄绿色圆形小体；高倍镜下观察，卵囊内部可见颗粒状或条索状阴影（图2）。
2.3 隐孢子虫卵囊大小
测量腹泻儿童、狗、大鼠粪便涂片标本内各100个卵囊，其平均大小及外形指数分别为5.2 μm×4.7 μm、1.1，3.76 μm×3.59 μm、1.04，4.34 μm×4.02 μm、1.08。
2.4 动物人工感染结果
2只幼犬感染后1～2 d，精神及进食正常，粪便中见到少量卵囊；第3天精神不振，进食减少，出现腹泻，有一只幼犬每日腹泻6～10次，粪便中卵囊增多；第5～6天，粪便中有大量卵囊（图3）；第7～9天粪便中卵囊逐渐减少，腹泻也随之减轻。消化道不同部位内容物检查示：食管和胃内未见卵囊，而在十二指肠、空肠、回肠、回盲部及阑尾等部位均可见卵囊，以十二指肠处最多。测量100个卵囊，大小平均为5.18 μm×4.72 μm,外形指数为1.1。肉眼观察，十二指肠至结肠黏膜表面有多个大小不等的圆形或椭圆形溃疡。将溃疡面做组织学切片，苏木精伊红染色后光镜观察，在肠上皮细胞刷状缘见有圆形嗜碱性小体，有的部位绒毛变粗变短，有的部位绒毛缺失。扫描电镜下观察，有溃疡的肠壁组织可见虫体似图钉附着于肠黏膜表面（图4）。
图1 狗粪便内隐孢子虫卵囊 复染法×1 000（略）
图2 狗粪便内隐孢子虫卵囊 金胺酚染色×400（略）
图3 人工感染幼犬粪便内隐孢子虫卵囊 复染法×400（略）
图4 附着于肠黏膜的隐孢子虫 扫描电镜×6 500（略）
3 讨论
自美国1976年首次报道人体隐孢子虫感染以来,其在艾滋病病人中检出率高，危害大，已引起医学界广泛关注。国内外已有170多种动物感染的报道，也引起兽医界的重视。QUILEZ 等[14]报道西班牙北部27个猪场隐孢子虫感染率为21.9%;OLSON等[15]报道加拿大15个不同猪场的感染率为11%;美国、日本和德国等猪的感染率分别为7.1%、33.2%和1.4%[16]。国内猪隐孢子虫感染情况，北京、河南、湖南、安徽、广东、广州、贵州、四川、宁夏、山东等地均有报道，感染率最低为1.12%，最高达89.7%[17]。本文调查青岛地区猪隐孢子虫检出率为4.71%，高于广州而低于其他省市报道，原因可能与饲养条件及检查方法不同有关。狗隐孢子虫感染的资料少见，本文农村家养狗的隐孢子虫检出率达22.20%。猫隐孢子虫感染的资料仅见于云南左仰贤等[7]1990年报道的25%，本文猫粪便中未查到隐孢子虫，可能与检查数量少有关。李文盛等[18]报道实验动物兔隐孢子虫感染率为20%，刘雪筠[19]报道昆明鼠、NIH鼠和BALB/C鼠分别为55.0%、41.6%和12.5%。而本文调查显示，实验动物小鼠、大鼠和兔分别为31.03%、40.00%和15.94%。
隐孢子虫通常寄生于宿主肠道内，偶尔在呼吸道、胰管、胆管及胆囊也可发现。以前隐孢子虫病的诊断主要以肠黏膜组织活检中查到虫体为依据，从而限制了临床应用。粪便检查方便实用，但对排卵囊较少者极易漏诊或误诊。在生理盐水涂片的粪便标本中，隐孢子虫不易与某些发光的小体相鉴别。我们认为，检查大量新鲜粪便标本时，有荧光显微镜的实验室，可先做金胺酚染色，用荧光显微镜检查；可疑者再行改良抗酸染色，这样既可提高检出率，又节约人力物力。在没有荧光显微镜的实验室,直接使用复染法可获得良好效果。对甲醛液保存时间较长的标本，金胺酚染色法染色后，用体积分数0.03盐酸乙醇脱色5 min，再用改良抗酸法染色,可大大提高卵囊检出率, 这对于进行大规模流行病学调查和教学标本的制作具有重要意义。
为研究隐孢子虫的宿主特异性和传染性，动物分离虫株对不同种动物的感染实验已有许多报道，但分离人株虫源对动物的实验感染报道则较少见。TZIPORI等[20]将从腹泻病人分离出的卵囊接种给2只刚出生的羔羊,3 d后出现精神不振、腹泻和不吃奶,在粪便中查到卵囊,在1只羔羊的小肠观察到黏膜改变。本文用从腹泻儿童粪便中分离出的卵囊感染2只幼犬，结果也产生明显腹泻症状，排出的卵囊经光镜和电镜观察，其大小、形态结构与人株的相似，证明隐孢子虫人株对狗无宿主特异性，并且具有明显致病性。
对隐孢子虫卵囊大小测量结果显示，腹泻儿童、狗及大鼠粪便内的卵囊大小接近微小隐孢子虫卵囊。研究已证明，哺乳动物隐孢子虫在人类隐孢子虫病的传播中起着重要作用。故应加强对我省哺乳动物隐孢子虫感染的调查研究，尤其是做好对实验动物的处理，预防动物隐孢子虫对操作人员的感染，对防治该寄生虫病将大有裨益。
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