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脑缺血再灌注后大鼠IGF1及其受体表达对其神经行为的影响

浏览15次时间：2012年3月30日 11:02

作者：孙锋刘蔚丁晓洁王超郭云良

【摘要】　　目的观察脑缺血再灌注后大鼠胰岛素生长因子1(IGF1)及其受体（IGF1R）表达对其神经行为的影响。方法成年健康雄性Wistar大鼠28只，应用线栓法经左侧颈外内动脉插线建立大脑中动脉闭塞再灌注（MCAO/R）模型。应用BEDERSON评分法评价脑缺血再灌注后神经行为功能，免疫组织化学技术检测IGF1和IGF1R表达。结果脑缺血再灌注后各组动物均出现不同程度的神经功能受损，从再灌注3 d开始神经功能逐渐恢复，但至再灌注7 d才有显著性差异。免疫组化检测显示，脑缺血再灌注后脑组织IGF1和IGF1R表达区域和时相变化规律基本一致，再灌注12 h～7 d持续高表达，1～3 d达高峰。结论脑缺血再灌注后IGF1和IGF1R的早期表达可能对神经功能恢复有一定的促进作用。
【关键词】脑缺血神经行为功能胰岛素生长因子 1 胰岛素生长因子 1受体
　　［ABSTRACT］ Objective To investigate the effects of insulinlike growth factor (IGF1) and its receptor (IGF1R) on neurobehavior after cerebral ischemic reperfusion in rats. Methods A middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model was made in 28 healthy male adult Wistar rats, the neurobehavior of these rats was evaluated via Bederson,s score, and expressions of IGF1 and IGF1R were determined by immunohistochemical assay. Results All the MCAO/R animals appearred different extent of neurofunctional impairment. Recovery started from the 3rd day after reperfusion, its significant improvement on 7th day. The expressions of IGF1 and IGF1R lasted for 12 h-7 days after reperfusion, reached its peak for 1-3 days, which was basically consistent in area and timephase. Conclusion The early expressions of IGF1 and IGF1R might enhance the neurofunctional recovery after cerebral ischemic reperfusion.

　　［KEY WORDS］ Brain ischemia; Neurobehavioral function; Insulinlike growth factor 1; Insulinlike growth factor 1 receptor

　　胰岛素样生长因子（IGFs）是一类多肽，参与多种生理功能，是机体组织细胞增殖、分化和成熟过程中重要的细胞因子，因其结构与胰岛素前体有高度同源性，且可作用于胰岛素受体而得名。胰岛素生长因子1(IGF1)是一种含有70多个氨基酸的碱性肽，可介导生长激素对机体的促生长作用。IGF1在脑组织中存在，是出生后大脑发育所必需的生长调节因子[1]。研究结果表明，脑缺血后脑内IGF1 mRNA表达增高，并且游离的IGF1浓度上升，可能有神经元保护作用[2]。IGF1的大部分细胞效应是通过 IGF1受体（IGF1R）实现的。本实验旨在观察脑缺血再灌注后脑内皮质区和纹状体区IGF1和IGF1R表达对大鼠神经行为功能的影响。
　　1 材料与方法
　　1.1 动物模型的建立

　　成年健康雄性Wistar大鼠28只，体质量20～260 g，清洁级，由山东大学实验动物中心提供，合格证号：鲁动质字20021024。随机分为脑缺血1 h再灌注6 h、12 h、1 d、3 d、7 d、14 d和假手术组，每组4只。应用线栓法经左侧颈外内动脉插线建立大脑中动脉闭塞再灌注（MCAO/R）模型。模型成功的标志：动物苏醒后出现左侧Horner征、右侧以前肢为重的偏瘫，爬行时向右侧划圈。假手术组除不插线外，其余步骤同实验组。实验中出现呼吸困难、出血过多、死亡以及术后2 h仍不能苏醒的动物弃去不用，并另选动物补足4只。
　　1.2 神经行为功能测试
　　各组动物分别于脑缺血再灌注后6 h、12 h、24 h、3 d、7 d、14 d按BEDERSON评分法评分[3]。
　　1.3 标本的采集和处理

　　各组大鼠按规定的再灌注时间点取材，假手术组于术后24 h取材。以100 g/L水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉动物，用40 g/L甲醛溶液经心脏灌注固定，断头完整取脑，置于40 g/L甲醛溶液后固定2 h，蒸馏水浸泡4 h。切取视交叉后方约5 mm的脑组织，常规脱水、透明、石蜡包埋。自视交叉后缘开始连续冠状切片（厚度5 μm），每隔10张抽取1张，贴于多聚赖氨酸处理的玻片上，晾干备用。甲苯胺蓝染色尼氏体呈深蓝色，核染色呈淡蓝色，背景浅淡。
　　1.4 免疫组化染色

　　兔抗大鼠IGF1和IGF1R单克隆抗体由武汉博士德生物工程有限公司提供，链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶连接法（SP）免疫组化试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供。标本切片常规脱蜡、水化，按试剂盒提供的实验步骤操作，DAB显色，光镜下观察，胞浆出现棕色颗粒为阳性着色。高倍镜下（400倍）在皮质区和纹状体区随机各取4个视野计数阳性细胞，结果以±s表示。
　　1.5 统计学分析

　　采用SPSS 11.0软件进行统计学分析，组间比较采用t检验。
　　2 结果
　　2.1 神经行为功能评分

　　假手术组动物神经功能评分均为0分（无神经损伤症状），脑缺血再灌注后各组动物均出现不同程度的神经功能缺损，评分为1～3分。从时间上来看，再灌注6 h～1 d神经功能缺损明显，从再灌注3 d开始，各组动物神经功能逐渐恢复，评分逐渐减少，脑缺血再灌注后7、14 d神经功能评分与再灌注6 h相比较，差异有显著意义（t=5.172、3.846,P<0.05）。见表1。
　　2.2 甲苯胺蓝染色检查

　　假手术组脑组织神经细胞形态结构正常、排列均匀，呈卵圆形或多边形，细胞浆尼氏体呈深蓝色，细胞核呈均匀淡蓝色。脑缺血损伤区神经细胞出现核固缩、不规则，细胞周围出现明显的周隙，染色加深呈紫蓝色，核仁消失，并有许多散在的细胞碎片（图1、2）。
　　2.3 IGF1表达

　　假手术组脑组织可见少量着色较浅的IGF1阳性细胞。缺血再灌注6 h后脑皮质区和纹状体区IGF1阳性细胞数开始增加（图3），从再灌注12 h～7 d 一直持续高表达，其中以再灌注1～3 d最高，与假手术组比较差异有显著性（t=1.86～9.07,P<0.05）。见表1。

2.4 IGF1R表达

　　假手术组脑组织神经细胞IGF1R表达较微弱，阳性细胞数量较少，着色较浅。脑缺血后神经细胞IGF1R表达增强（图4），主要位于皮质区和纹状体区，脑缺血再灌注后6 h神经元即出现IGF1R的表达，随着再灌注时间的延长逐渐增强，阳性细胞增多，着色加深，再灌注1～3 d达高峰，之后逐渐减弱，至再灌注7 d与假手术组比较均有显著性差异(t=2.60～6.85,P<0.05)。见表1。
　　图1 假手术组脑组织神经细胞形态甲苯胺蓝染色×400 （略）
　　图2 脑缺血再灌注（1 d）损伤后神经细胞核固缩甲苯胺蓝染色×400（略）

　　图3 脑缺血再灌注（12 h）损伤后神经细胞IGF1表达增强 SP染色×400（略）
　　图4 脑缺血再灌注（3 d）损伤后神经细胞IGF1R表达增强 SP染色×400（略）
　　3 讨论

　　研究表明，IGF1作为一种神经营养因子具有多方面的功能，其在脑组织中具有促进神经元和神经胶质细胞分化、增殖和促进脑组织生长、发育的作用。赵仁亮等[4]观察显示，帕金森病人血浆IGF1水平下降，分析其可能对痴呆病人有神经保护作用。而IGF1对脑缺血再灌注损伤也有重要的保护作用[2]。在生理状态下，中枢神经系统有广泛的IGF1免疫反应性和IGF1mRNA的表达，并发现IGF1受体在蛋白、mRNA和DNA等不同水平广泛存在于中枢神经系统，IGF1在正常成熟的脑组织中呈广泛的低水平表达。脑缺血后，IGF1系统被激活，其在脑组织中的表达和分布均发生明显改变[5]，同时也激活其他保护因子[6]。IGF1的表达还与损伤程度有关，损伤较轻时，IGF1仅表达于大脑皮质组织；损伤较重时，弥漫分布于整个受损半球。BEILHARZ等[7]报道，缺血5 h内IGF1便在缺血侧大脑半球血管内积聚，3 d后IGF1 mRNA出现在迟发性神经元死亡区被激活的小胶质细胞上，与此同时IGF1表达也增高，并于5 d达高峰。脑缺血可诱导IGF1 mRNA在小胶质细胞上的表达，小胶质细胞分泌的IGF1可显著延缓神经元和星形胶质细胞的损害[8]。SCHEEPENS等[8]在慢性缺血动物模型中发现，缺血后72 h IGF1 mRNA在受损半球表达明显增加，14 d也明显增加。脑缺血低氧性损伤后2 h给予外源性IGF1可减少继发性神经元脱失，表明IGF1可能是一种神经保护物质。本实验结果与上述报道存在一定的差异，可能因各家动物模型种类、缺血时间和实验条件存在差异所致。
　　表1 大鼠脑缺血再灌注后神经行为功能评分、IGF1和IGF1R阳性细胞的观察（略）
　　与再灌注6 h组比较，#t=5.172、3.846, P<0.05；与假手术组比较，*t=1.86～9.07,P<0.05
　　GUAN等[9]在低氧缺血损伤后观察到神经细胞坏死和凋亡，神经细胞表面IGF1与IGF1R结合明显处细胞膜完整，从而也揭示IGF1神经保护作用是通过其受体作用实现的。脑缺血损伤后，IGF1治疗可以明显缩小脑皮质梗死范围，减少神经元缺失，改善躯体感觉功能[10]。随着损伤的加重，IGF及其受体的合成也增多，促进受损区神经胶质细胞分化增生，通过刺激IGF1的活性，磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）被激活，促进神经胶质细胞分化为星型和少突胶质细胞，参与轴突的修复。本实验显示，脑缺血再灌注后神经功能出现明显缺损，由于自身的代偿和保护作用，从再灌注3 d开始有所恢复，至再灌注7 d明显恢复。脑组织IGF1和IGF1R表达区域和时相变化规律基本一致，主要在皮质和纹状体区，再灌注12 h～7 d持续高表达，1～3 d达高峰，提示其早期表达对神经功能恢复有一定的作用，但这一作用是有限的，持续时间也较短。因此，及时补充外源性IGF1可为脑组织提供有效的营养和支持作用，有望成为治疗缺血性脑血管病的有效方法。
【参考文献】
　　[1]于恺,田沈,孟秀君,等. 胰岛素对大鼠脑缺血再灌注时神经元凋亡及其相应基因的调控[J]. 中国临床康复, 2004,7(16):23152316.
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　　[4]赵仁亮,王春霞. 帕金森病非痴呆和痴呆病人血浆IGF1的变化[J]. 青岛大学医学院学报, 2003,39(4):372374.

　　[5]徐忠信,何金婷,莽靖,等. 局灶性脑缺血及再灌注损伤IGF1表达的动态变化[J]. 吉林大学学报：医学版, 2005,31(3):401403.

　　[6]CHAVEZ J C, LAMANNA J C. Activation of hypoxiainducible factor1 in the rat cerebral cortex after transient global ischemia: potential role of insulinlike growth factor1[J]. J Neurosci, 2002,22(20):89228931.

　　[7]BEIHARZ E J, RUSSO V C, BUTLER G, et al. Coordinated and cellular specific induction of the components of the IGF/IGFBP axis in the rat brain following hypoxicischemic injury[J]. Brain Res Mol Brain Res, 1998, 59(2):119134.

　　[8]SCHEEPENS A, SIRIMANNE E S, BREIER B H, et al. Growth hormone as a neuronal rescue factor during recovery from CNS injury[J]. Neuroscience, 2001,104(3):677687.

　　[9]GUAN J, BBIHARZ E J, SKINNER S J, et al. Intracerebral transportation and celluar localization of insulinlike growth factor1 following central administration to rats with hypoxioischemic brain injury[J]. Brain Res, 2000,853(2):163173.

　　[10]GUAN J, MILLER O T, WAUGH K M, et al. Insulin like growth factor 1 improves somatosensory function and reduces the extent of cortical infarction and ongoing neuronal loss after hypoxia irchemia in rats[J]. Neuroscience, 2001,105(2):299306.