p185、p53、bcl2和nm23H1蛋白在胆管癌组织的表达及其意义
【摘要】 目的 探讨p185、p53、bcl2和nm23H1蛋白在胆管癌组织表达的表达及临床意义。方法 应用免疫组化方法检测46例胆管癌和10例正常胆管组织中p185、p53、bcl2及nm23H1蛋白表达，并结合临床病理特征进行分析。结果 胆管癌中p185及p53阳性表达率均显著高于正常胆管组织(χ2=8.50、5.30，P<0.05)，而bcl2及nm23H1阳性表达率显著低于正常胆管组织(χ2=5.91、4.08，P<0.05)。p185、p53高表达和bcl2、nm23H1低表达与胆管癌的分化程度、TNM分期和转移相关（χ2=4.00～6.88，P<0.05）。结论 p185、p53、bcl2和nm23H1蛋白可作为评估胆管癌生物学行为和预后的参考指标。
【关键词】 胆管肿瘤 基因表达 肿瘤转移 免疫组织化学
［ABSTRACT］ Objective To investigate the protein expression of p185, p53, bcl2 and nm23H1 in cholangiocarcinomas (ChC) and its clinical significance. Methods Immunohistochemical method was used to study the expression of p185, p53, bcl2 and nm23H1 in 46 cases of ChC and normal bileduct tissue in 10 cases. The results were analyzed combined with clinical and pathological characteristics. Results The positive rate of p185 and P53 in ChC was higher than that in normal control (χ2=8.50,5.30;P<0.05), and that of bcl2 and nm23H was lower (χ2=5.91,4.08;P<0.05). The higher expression of p185 and p53, and the lower expression of bcl2 and nm23H1 was positively correlated with the differentiation, TNM phase, and metastasis of ChC (χ2=4.00-6.88,P<0.05). Conclusion Expression of p185,p53,bcl2 and nm23H can be used as reference in predicting the biological behavior and prognosis of ChC.
［KEY WORDS］ Tumor of bile duct; Gene expression; Tumor metastasis; Immunohistochemistry
肿瘤的发生是一个多基因参与的多步骤过程，包括原癌基因的激活或抑癌基因的失活等。胆管癌是较常见的恶性肿瘤之一,其发病率近年来呈上升趋势，该病临床具有诊断困难、恶性度高、转移早、预后差等特点。本研究用免疫组化方法检测cerbB2 (p185)、p53、bcl2和nm23H1蛋白在胆管癌组织的表达，探讨其表达与胆管癌分化程度和转移的关系，为预测病人预后提供参考指标。
1 材料与方法
1.1 材料
取我院1992年1月～2006年12月间手术切除并经病理证实的胆管癌标本46例，其中男31例，女15例, 年龄23～75岁，平均年龄（50.9±12.7）岁；高、中分化癌32例，低分化癌14例；伴有转移者28例(包括淋巴结、肝、胆囊、肠系膜和胰腺等),无转移者18例。按TNM分期:Ⅰ期8例,Ⅱ期17例，Ⅲ期13例，Ⅳ期8例。取同期正常胆管组织10例作对照。标本经40 g/L甲醛固定，石蜡包埋,4～5 μm厚连续切片。
1.2 试剂
鼠抗人p18，p53，bcl2和nm23H1单克隆抗体和LSAB试剂盒均购自迈新生物技术公司（均为即用型）。
1.3 免疫组织化学染色
采用微波链霉菌素生物素（MWLSAB)免疫组织化学法和微波金属盐抗原修复技术。即切片常规脱蜡水化后,放入枸橼酸缓冲液(10 mmol/L,pH 6.0)内,用微波仪170 W辐射5 min，冷却后水洗。其他操作流程同常规LSAB法，所不同者为三步抗原孵肓和正常血清封闭用微波仪130 W分别辐射5 min，保温2 min即可。实验用已知p185、p53、bcl2和nm23H1阳性乳癌组织作阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。H2O2DAB显色。
2 结果
2.1 各种蛋白在正常胆管和胆管癌组织中的表达
免疫组织化学染色显示，p185阳性产物主要定位于细胞膜，少量在细胞浆（图1）；p53阳性产物定位于细胞核（图2）；bcl2和nm23H1阳性产物定位于细胞浆（图3、4）。46例胆管癌中，p185、p53、bcl2及nm23H1蛋白的阳性表达率分别为60.9%（28/46）、50.0%（23/46）、47.8%（22/46）和54.3%（25/46）。10例正常胆管组织中,p185和p53均无阳性表达，bcl2及nm23H1蛋白阳性表达率分别为90.0%（9/10）、100.0%（10/10）。p185和p53在胆管癌组织中的表达阳性率均显著高于正常胆管组织（χ2=8.50、5.30，P<0.05），bcl2及nm23H1蛋白阳性表达率均显著低于胆管癌组织（χ2=5.91、4.08，P<0.05）。
2.2 各种蛋白表达与胆管癌临床病理参数的关系
p185、p53、bcl2及nm23H1蛋白表达均与胆管癌病人性别和发病年龄无关（P>0.05）,而与胆管癌分化程度、TNM分期和转移状况密切相关（χ2=4.00～6.88，P<0.05）。见表1。
2.3 胆管癌中4种蛋白表达之间的相关性
在p185阳性的28例胆管癌中p53、bcl2和nm23H1阳性表达者分别为21例（75.0%）、10例（35.7%）和11例（39.3%），在p185阴性的18例胆管癌中，p53、bcl2和nm23H1阳性者分别为2例（11.1%）、12例（66.7%）和14例（77.8%），胆管癌中p185表达与p53表达呈正相关（r=0.62，P<0.05），与bcl2及nm23H1表达则均呈负相关（r=-0.30、-0.38，P<0.05）；在p53阳性的23例胆管癌中，bcl2和nm23H1阳性者分别为7例（30.4%）和8例（34.8%）、在p53阴性的23例胆管癌中bcl2和nm23H1阳性者分别为15例（65.2%）和17例（73.9%），胆管癌中p53表达与bcl2和nm23H1表达呈负相关（r=-0.35、-0.39，P<0.05）；在bcl2阳性表达的22例胆管癌中，nm23H1阳性者19例（86.4%），在bcl2阴性的24例胆管癌中nm23H1阳性者6例（25.0%），胆管癌中bcl2表达与nm23H1表达呈正相关（r=0.62，P<0.05）。
图1 胆管癌细胞质p185免疫组化阳性染色 WMLSAB法×200（略）
图2 胆管癌细胞核p53免疫组化阳性染色 WMLSAB法×200（略）
图3 胆管癌细胞质bcl2免疫组化阳性染色 WMLSAB法×200（略）
图4 胆管癌细胞质nm23H1免疫组化阳性染色 WMLSAB法×200（略）
表1 各种蛋白表达与胆管癌临床病理参数的关系（略）
3 讨论
p185是癌基因cerbB2编码的具有酪氨酸蛋白激酶（TPK）活性的跨膜受体蛋白,其相对分子质量为185 000。研究发现，p185蛋白与表皮生长因子受体（EGTR）有高度的同源性，它可能与未知配体结合后，通过增强蛋白激酶的活性，促进细胞的分裂、增殖和转化[1]。p185基因扩增或过表达与肿瘤的发生发展过程密切相关,提示死亡危险性增大,是癌症进展和转移的标志，表明临床预后较差[2,3]。p53基因是人类肿瘤研究中较为重要的肿瘤抑制基因，分为野生型和突变型。野生型p53基因是一种肿瘤抑制基因，参与细胞的分化调控，并以基因调控方式阻抑癌基因的活动，阻止异常染色体的形成。突变型p53基因表达与多种恶性肿瘤的发生、发展、浸润、转移及预后相关[3～5]。bcl2基因是最早发现的细胞凋亡抑制基因，定位于染色体18q21。bcl2是调控细胞凋亡的主要因子，具有抑制细胞凋亡、延长细胞寿命的作用。bcl2高表达可使衰亡的细胞得以继续生存，然而因染色体不稳定，易发生基因突变，这种细胞容易癌变[5,7]。nm23是一种肿瘤抑制相关基因,分为nm23H1和nm23H2两个亚型，其编码产物二磷酸核苷激酶(NDPK)与微管聚合、G蛋白介导的信号传递、细胞与周围组织附着力、完整的基底膜形成及转录调节有关。nm23表达降低与肿瘤的淋巴结转移、高复发率及低生存率等有显著相关性[7]。本研究采用免疫组化方法，联合检测了上述4种蛋白在胆管癌和正常胆管组织中的表达水平。结果显示，p185和p53蛋白表达阳性率在胆管癌中均显著高于正常胆管组织，bcl2和nm23H1蛋白表达阳性率在胆管癌中均显著低于正常胆管组织。随着胆管癌的临床分期增高、分化程度减低和器官转移，p185和p53蛋白表达阳性率显著增高，bcl2和nm23H1蛋白表达阳性率则显著减低。结果显示，p185、p53蛋白高表达及bcl2、nm23H1蛋白低表达均在胆管上皮细胞的恶性转化和肿瘤侵袭转移的生物学行为过程中起到重要促进作用。因此，在临床病理活检中，联合检测其蛋白表达有助于深入了解肿瘤的发生发展，并可为诊断、预后判断和临床基因治疗提供重要依据。
在恶性肿瘤发生的癌基因研究中，许多学者提出了基因协同作用假说，认为在恶性肿瘤发生、发展和转移的各阶段,至少有两个或两个以上功能不同的异常激活的基因各自发挥不同作用，并在时间和空间上相互配合，协同促进了细胞的癌变。本研究结果显示，在胆管癌中p185与p53表达之间、bcl2与nm23H1表达之间呈正相关，而p185、p53与bcl2、nm23H1表达之间呈负相关。结果显示，4种蛋白表达在胆管癌的发生发展、临床进展和转移的病理过程中，可能发挥着协同效应，共同参与了胆管癌的演化过程。
【参考文献】
[1]NAKAMURA H, KANASAKI N, TAGUCHI M, et al. Association of HER2 overexpression with prognosis in nonsmall cell lung carcinoma a metaanalysis[J]. Cancer, 2005,103(9):18651873.
[2]谷化平,刘艳茹,尚培中. 胆囊肿瘤组织CD44v6和CerbB2的表达及相关性研究[J]. 临床肝胆病杂志, 2002,18(6):370371.
[3]BRUWER M, SCHMID K W, SENNINGER N, et al. Immunohistochemical expression of p53 and oncogenes in ulcerative colitisassociated colorectal carcinoma[J]. World J Surg, 2002,26(3):390396.
[4]张顺,相亭海,李玉军. P16、P53和SMAD4蛋白在胰腺癌组织中的表达及其临床意义[J]. 青岛大学医学院学报, 2006,42(2):135139.
[5]王雪鹤,樊希芬,王璇. P53蛋白在卵巢上皮肿瘤组织中的表达及意义[J]. 青岛大学医学院学报, 2006,42(3):255256.
[6]丁守怡,阎丽平,时飞,等. 胃癌及癌旁组织中Bcl2和Ki67蛋白表达及其意义[J]. 齐鲁医学杂志, 2005,20(2):126129.
[7]谷化平,尚培中,张正猛,等. 抑癌基因蛋白与前列腺癌转移的关系[J]. 山西医科大学学报, 2005,36(1):120121.
