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CD59基因突变在肿瘤逃逸中的作用

浏览29次 时间:2012年3月30日 11:12

【摘要】    目的 构建CD59突变的重组体,研究Hela细胞中CD59基因突变引起肿瘤凋亡相关分子caspase3表达的变化。方法 采用重组聚合酶链反应定点诱变技术,将CD59的第39~41位氨基酸突变为色氨酸,克隆入pALTERMAX质粒,采用阳离子脂质体法将重组质粒转染Hela细胞。G418筛选稳定表达细胞克隆,用免疫荧光、ELISA、流式细胞术筛选出高表达突变CD59的细胞株,用免疫组化法检测转染前后Hela细胞内caspase3表达的变化。结果 酶切鉴定和序列测定均证实成功构建了CD59氨基酸突变的重组质粒。转染突变CD59后Hela细胞内caspase3表达明显减少,与转染正常CD59的Hela细胞比较差异有显著意义(t=2.846,P<0.01)。结论caspase3表达变化可能是CD59引起肿瘤逃逸的另一途径。 
【关键词】  抗原 CD59 点突变 肿瘤逃逸 基因重组 Hela细胞 Caspase 3
  [ABSTRACT] Objective To construct mutant CD59 molecular, and study the alleosis in the expression of caspase3 correlative with tumor apoptosis brought about by CD59 mutation in Hela cells. Methods Using polymerase chain reaction sitedirected mutagenesis, the amino acid of the 39th and the 41th mutated to tryptophanes. Mutant CD59 DNA  inserted into the vector pALTERMAX and transfected into the Hela cells via lipofectamine method. Stable expression clones were selected by the addition of G418. The G418resistant clones which expressed relatively high levels of mutant CD59 were sorted by immunofluorescence method, ELISA and flow cytometry. The expression of caspase3 in Hela cells before and after transfection was tested immunohistochemically. Results Recombinant plasmids of pALTERMAXCD59 had been successfully constructed according to sequence of enzyme digestion analysis and fragment investigation. The amount of caspase3 in Hela cells which were transfected was obviously lower than that in Hela cells which were transfected with nomal CD59, and the difference was obvious (t=2.846,P<0.01). Conclusion Another way by which CD59 leads the tumor escaping may be the expression changing of caspase3.
    
  [KEY WORDS] Antigens, CD59; Point mutation; Tumor escaping; Mutagenesis; Hela cells; Caspase3
    
  众所周知,肿瘤的免疫逃逸是导致治疗方案失败的重要原因[1]。至今为止,国内外学者对肿瘤逃逸的机制已有多方面的阐述。近年来,国外学者在肠道、卵巢及前列腺等多种实体肿瘤细胞中发现有CD59分子的高表达。CD59是一种补体调节蛋白,其以糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚着于多种细胞膜表面[4],通过阻止补体攻膜复合物(MAC)的装配保护宿主细胞免受补体介导的溶细胞作用[5,6]。近年来的研究显示,CD59与肿瘤的生长失控和转移密切相关[2,3],但有关其与肿瘤逃逸的相关性研究目前尚未有定论。本文通过研究caspase3的表达变化,探讨CD59与肿瘤逃逸的相关活性位点,为肿瘤的靶向治疗提供新的思路。
  1  材料和方法
  1.1  材料
    
  pALTERMAX、pALTERCD59由美国哈佛大学惠赠, EcoR Ⅰ酶、DNA聚合酶、T4连接酶均购自大连TaKaRa公司,细菌菌株E.coli.JM109为本室保存,小牛血清为天津灏洋生物制品科技责任有限公司产品,Trypsin(1∶250)购自SinoAmerican Biotec公司,RPMI 1640培养基、G418选择抗生素、LipofectamineTM2000均为Invitrogen公司产品,鼠抗人CD59单抗为本实验室制备,羊抗鼠IgG2aFITC、羊抗人CD59单抗和HRP标记兔抗山羊IgG(H+L)均购自北京中山生物技术有限公司,荧光抗体CD59FITC购自COULTER 公司,caspase3免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司,Hela细胞由本实验室保存。设计两对寡核苷酸引物,通用引物:pT7,T3;突变引物:M/F,M/R。以上引物均购自上海生物工程有限公司。
  1.2  方法
  1.2.1  重组真核表达载体的构建  在原构建的重组质粒pALTERCD59的基础上, 设计两对反向互补、含有突变位点的引物及一对通用引物,由生物公司合成。其序列如下。通用引物pT7:5′TAATACGACTCACTATAGGC3′;通用引物T3:5′TATTCAGGCGTAGCAACCAG3′ ;突变引物M/F:5′GTGTATAACAAGTGGTGGTGGTTTGAGCATTGC3′; 突变引物M/R:5′ATGCTCAAACCACCACCACTTGTTATACACTTG3′。 以已构建的CD59 cDNA重组质粒为模板,以常规引物pT7和诱变引物M/R进行PCR1反应,以已构建CD59 cDNA重组质粒为模板,以常规引物T3和诱变引物M/F行PCR2反应,将纯化PCR1和PCR2产物等量混合为模板,以通用引物pT7和T3行PCR扩增反应,从而得到所需的诱变位点的大量DNA片段,该突变可使CD59第39~41位氨基酸均突变为色氨酸。经琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物,并回收目的条带。将质粒pALTER及含有全长突变CD59基因的PCR产物用EcoR Ⅰ单酶切后,经T4 DNA连接酶作用,使突变基因插入到pALTER 质粒的EcoR Ⅰ位点, 以构建重组真核表达质粒。用TSS法使重组质粒转化感受态的细菌JM109,经氨苄青霉素筛选后,挑取单个菌落用酚抽提法提取质粒,以EcoR Ⅰ酶切鉴定。对筛选的克隆进行序列测定,由上海生物工程有限公司完成。
  1.2.2  Hela细胞的转染及阳性克隆的筛选  重组质粒的转染参照 LipofectamineTM2000的说明书进行。转染后24 h,将细胞按1∶10稀释传代,24 h后加入含有800 g/L G418的选择性培养基,筛选2周后套取单克隆并继续筛选2周,扩大培养始终维持G418在400 g/L。连续传代10次后,收集细胞进行鉴定。
  1.2.3  Hela细胞中突变CD59的检测  ①免疫荧光技术: 刮取细胞, 离心去上清, 用PBS洗3次。涂片、干燥后, 用乙醇固定后晾干, 加入鼠抗人CD59单克隆抗体,37 ℃孵育30 min, 洗涤后加入羊抗鼠的FITCIgG二抗,于37 ℃孵育30 min,洗涤,干燥后在荧光显微镜下观察结果。②ELISA法:收获并裂解细胞,测定并调节标本和对照蛋白质质量浓度为5 mg/L,用包被液以1∶1、1∶2、1∶4 稀释待测标本和空白PALTER 对照,并分别设6个复孔,每孔加入100 μL样品,4 ℃包被18 h,封闭,加入鼠抗人CD59抗体后,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG,然后加底物显色液(邻苯二胺)显色,测定495 nm处吸光度(A)值。③流式细胞术:刮取转染突变CD59的细胞株(5×108/L),加入FITC抗人CD59单克隆抗体,设置野生Hela细胞为对照,实验组及对照组均设定FITCIgG二抗,同型对照,上机检测。
  1.2.4  肿瘤逃逸相关分子caspase3的检测  用免疫组织化学法检测转染突变CD59后Hela细胞内caspase3表达的变化,操作按照caspase3免疫组化试剂盒使用说明书进行。用Imageproplus 5.0软件对所得图片进行吸光度测量。
  1.3  统计学处理
    
  数据间比较采用t检验。
  2  结果
  2.1  重组质粒的鉴定
    
  以EcoR Ⅰ酶对重组质粒进行酶切,获得1条496 bp的电泳带,与所插入的片段的大小相一致(图1)。测序结果表明,突变CD59pALTER含有突变CD59的全长cDNA序列。见表1。
  2.2  荧光免疫组化检测
   
  荧光显微镜下可见转染突变CD59的Hela细胞表面的荧光亮度明显强于未转染突变CD59的Hela细胞。
  2.3  ELISA检测
    
  转染突变CD59的Hela细胞裂解产物的CD59蛋白表达量明显高于Hela对照组,差异有显著性(t=3.195~4.842,P<0.01)。见表2。
  2.4  流式细胞术检测
    
  转染突变CD59的Hela细胞的CD59表达率为78.32%(图2)。
  2.5  转染前后Hela细胞内caspase3的表达变化

转染突变CD59后Hela细胞的平均吸光度值为0.189±0.029,转染正常CD59的Hela细胞的平均吸光度值为0.202±0.031,两者比较,差异有显著性(t=2.846,P<0.01)。
  3  讨论
    
  CD59是一种GPI蛋白,可以作用于补体激活终末阶段的MAC的形成,使肿瘤细胞免受补体介导的溶细胞作用从而引起肿瘤逃逸。目前已有研究显示,CD59分子中N37~H44位基因突变可导致糖尿病的发生,其NMR结构显示抗补体活性区域也主要集中于N37~H44之间[7]。肿瘤逃逸相关活性位点虽然尚未有明确定位,但无疑为寻找该活性位点提供了理论性的指导,从而引导我们发现肿瘤逃逸中可能存在的其他途径。 
  表1  突变人CD59与野生型人CD59的差别(略)
    
  表2  ELISA实验结果(略)
  与野生Hela细胞比较,*t=3.195~4.842,P<0.01
  图1  重组质粒鉴定结果
    
  ①DNA Marker;②酶切的重组突变CD59质粒;③未经酶切的突变CD59重组质粒AB
  图2  流式细胞术检测结果(略)
  对于类似p53编码基因等抑癌基因的研究显示, 肿瘤的发生与肿瘤细胞丧失了正常的凋亡机制有关[8]。近年来的研究还显示,在一些药物诱导的细胞凋亡中,存在caspase3的活化[9,10]。本课题组已有研究成果显示,CD59基因突变使凋亡相关因子caspase3表达发生变化。
    
  caspase3是细胞凋亡过程中的关键分子。 细胞凋亡需经两条不同的途径:一条是Fas与细胞表面的死亡受体FasL结合后,首先激活caspase8,然后再活化下游的caspase(主要为caspase3);另一条是各种毒性物质通过刺激线粒体释放的细胞色素C激活caspase9后,活化下游的caspase(主要也为caspase3),这两条途径均需激活caspase3。因此,通过使CD59的活性位点突变以影响其抗补体活性,并且通过影响caspase3的表达,进而影响肿瘤细胞的凋亡可能成为肿瘤治疗的新方法。
    
  本研究成功构建了CD59可疑活性氨基酸突变的重组体,使CD59第39~41位氨基酸均突变为色氨酸;Hela细胞转染突变的CD59后凋亡相关因子caspase3的表达量显著减少。说明CD59分子的色氨酸在突变CD59蛋白发挥抗肿瘤逃逸作用时充当重要角色,提示CD59引起肿瘤逃逸的另一途径可能是通过使凋亡相关因子caspase3的表达减少,使细胞凋亡减少,从而引起肿瘤细胞逃脱机体的免疫监视而实现的。
    
  综上所述,可以通过封闭CD59的活性位点,减弱CD59分子中的活性氨基酸的功能,提高caspase3活性使肿瘤细胞凋亡,同时减低其抗补体活性来促使肿瘤细胞不能逃避免疫杀伤,从来达到治疗肿瘤的目的。本研究将为肿瘤靶向治疗提供一条新思路,具有重要临床应用价值。
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